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內(nèi)切酶的酶切技術(shù)實驗原理值得關(guān)注!

發(fā)布時間: 2021-06-22  點擊次數(shù): 1597次
   內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離出來的一種能在特異位點切割DNA分子的核酸內(nèi)切酶,目前已從多種細(xì)菌中分離出超過400種,識別各自不同的核苷酸順序,這一順序大多為具有一對稱中心的回文序列,如從大腸桿菌中分離的EcoR I識別:…GAATTC…切割后產(chǎn)生
  …CTTAAG…
  …G和AATTC…的末端
  …CTTAA G…
  該末端由于有一段小的能互補(bǔ)配對的單鏈突出,故稱為粘性末端。切割后的末端為3’-OH和5’-磷酸基團(tuán)。即…G-OH
  …CTTAA-P。
  有的限制性酶識別四堿基對的順序,如San3A識別GATC;有的識別六堿基對,如上述的ECOR I。識別四堿基對的內(nèi)切酶由于識別順序在DNA出現(xiàn)的頻率更高(四堿基酶為44=256,六堿基酶為46=4096),因而可將DNA切割成更小的片段,而識別八堿基對的Not I
  …GCGGCCGC…
  …CGCCGGCG…。
  則識別和切割位點更少(48=65536),但堿基并不以均等的概率出現(xiàn),因而切割后產(chǎn)生的片段變化范圍很大。
  限制性內(nèi)切酶作用的溫度一般為37℃,反應(yīng)體系中以Mg2+為單獨的輔助因子,且要求pH緩沖在7.5左右。
  商品酶都保存在50%的甘油溶液中,-20℃貯存,活性通常較高,5u/μl(每單位即最適條件下1小時內(nèi)*酶解1μg DNA的酶量)。
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