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NEB內(nèi)切酶的對照實(shí)驗(yàn)怎么做

發(fā)布時(shí)間: 2022-09-26  點(diǎn)擊次數(shù): 1689次
  NEB內(nèi)切酶的對照實(shí)驗(yàn)怎么做
  NEB內(nèi)切酶可提供210多種內(nèi)切酶,其中有130多種內(nèi)切酶為重組酶。重組技術(shù)的運(yùn)用,使NEB能在提高內(nèi)切酶的純度及品質(zhì)的同時(shí),削減生產(chǎn)費(fèi)用。
  加入酶之前將反應(yīng)混合物混勻,可以用移液槍上下吹打或輕彈管壁,然后在離心機(jī)中快速離心。切忌振蕩混勻。
  一般情況下,我們推薦使用5-10單位酶量/μgDNA,基因組DNA用10-20單位酶量消化1小時(shí)。入內(nèi)切酶的量應(yīng)不超過總體積的10%,以避免甘油過量引起的星號活性。貯存液中的添加物和底物溶液中尚存的殘余物(會(huì)導(dǎo)致小體積反應(yīng)出現(xiàn)問題。如果在切割底物DNA時(shí)遇到了問題,建議加入以下對照實(shí)驗(yàn):
  1、酶切對照DNA(含有多個(gè)已知內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的DNA,如LambdaDNA或腺病毒-2DNA),以檢測內(nèi)切酶的活性。
  2、如果對照DNA能夠被切割而實(shí)驗(yàn)中的底物DNA不能,可以將這兩種DNA混合在一起再進(jìn)行酶切,以檢測實(shí)驗(yàn)用的底物DNA中是否存在抑制反應(yīng)的物質(zhì)。如果確實(shí)存在某種抑制因子(通常為鹽、EDTA或酚),則混合之后對照DNA也不能被切割。
  3、當(dāng)內(nèi)切酶在非zui適條件下使用時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生星號活性。
  4、可以通過以下方法降低星號活性:使用高保真(HF)內(nèi)切酶、縮短溫育時(shí)間、使用省時(shí)內(nèi)切酶或者增大反應(yīng)體積。
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